Биобанк

Биобанкинг в онкологии и радиологии

В 1998 г. был создан первый исследовательский биобанк в РФ для углубленного изучения постчернобыльских опухолей щитовидной железы. Число биобанков различного назначения неуклонно растет в мире, совершенствуется инфраструктура и кооперация. Разработаны и постоянно совершенствуются этические, правовые и методологические рекомендации по биобанкингу.

Объектами биобанкинга сегодня являются не только биологические образцы пациентов, но и биомедицинские характеристики последних в динамике. Особенности генетики, протеома и метаболизма опухолей в сопоставлении с их радиологической in vivo визуализацией необходимы для совершенствования персонализированной диагностики, лечения и прогноза его эффективности.

Анализируется доказательный международный опыт пробоподготовки и криоконсервации биологических образцов, информационной логистики и интеграционных решений в биобанкинге. Приводятся основополагающие принципы и модель современного биобанка в онкологии и радиологии, интегрирующих современные технологии цифровой персонализированной медицины и телемедицины. На наш взгляд, статья будет интересна широкому кругу специалистов в области биомедицины, особенно онкологам, радиологам, патологам, генетикам, специалистам по информационным технологиям.

Целью биобанкинга в медицине является изучение физиологических и патологических основ функционирования живых систем для улучшения профилактики и лечения болезней. Сегодня биобанк – это не только коллекция нативных биологических образцов (кровь, ткань, выделения) или их производных (клетки, ДНК, РНК), но и всей значимой биомедицинской информации о субъектах биобанкинга.

Есть различные способы сохранения тканей. Наиболее древними являются мумификация и бальзамирование. Для предотвращения деградации живой ткани после ее удаления из живого организма (операция, пункция) или его смерти возможно применение следующих методов:

1) криогенная консервация: глубокая заморозка от -18 до -196 °С;
2) химическая фиксация: обработка альдегидами, спиртами, кислотами, смесями;
3) пластинация (бальзамирование):замещение воды силиконом, смолой;
4) сушка или лиофилизация (мумификация): удаление воды (сушка);
5) ионные растворы (соли, катионы, кислоты и др.) – замена воды на катионные среды;
6) солидификация (кристаллизация): замораживание до образования льда под высоким давлением.

В патологической анатомии для хранения при комнатной температуре биологического материала (операционного, аутопсийного) издавна применяется сочетание следующих методов: химической фиксации (формалином), химической сушки (спиртами) и заливки (смесью парафина и воска/полимеров). Однако качество образцов парафиновых блоков в значительной степени зависит от используемых материалов и человеческого фактора.
Вариантов биологических образцов множество: кровь, сыворотка, костный мозг, спинномозговая жидкость, слюна, моча, кал, мокрота, волосы и пр. Огромный интерес для исследований в области онкологии представляют образцы опухолевой ткани. В целях сравнения желательно сохранить образец нормальной ткани органа или ткани, в которой развился опухолевый процесс, а также очаги рецидива опухоли в связи с тем, что опухоль может менять свою природу в процессе лечения и наблюдения.
Большинство биобанков находится в Европе, немало их в США и других странах мира. В 2013 г. Европейская комиссия создала консорциум “Биобанкинг и инфраструктура исследовательских биомолекулярных
ресурсов” (www.bbmri-eric.eu), который представляет собой наиболее обширную сеть биобанков. Международное общество по биологическим и экологическим репозиториям (ISBER) разработало руководство по лучшим практикам репозиториев биологических материалов для исследовательских целей.
Также на текущий момент идет утверждение единого ISO по биобанкам (ISO_DIS_20387 Biotechnology – Biobanking – General requirements for biobanking), который был разработан на базе Best practices ISBER.
В последнее время в мире сложилась устойчивая тенденция к развитию научного сотрудничества между биобанками.
Объектами коллекционирования современных биобанков являются не только биологические образцы, но и биомедицинские параметры состояния пациентов, предоставивших свои биологические образцы. По сути
это биомедицинские регистры нового поколения, обезличенные по морально-этическим соображениям (табл. 1). 

Таблица 1. Требования к информационной системе онкологического биобанка

РазделХарактеристикиФормат данных Временной фактор
Пациент
Демография
Антропометрия
(при необходимости)
Анамнез
Качество жизни
и жизненный статус
Пол, возраст, проживание, национальность
Рост, вес (динамика), окружность головы, стигмы, аномалии развития
Развития, семейный, онкологический, радиационный, инфекционный, иммунный, пр.
Жив/умер (причина);
осложнения (болезни, лечения, др.)
Текст/Даты/Числа
Текст/Числа
Текст/Числа
Текст/Даты/ Числа
Нет хронологии
Нет хронологии
Нет хронологии
Хронология
Опухоль
Патология и генетика
Метаболизм
Рецидивы
Цитология, гистология, ИГХ,
стадия опухоли, генетические маркеры
Онкомаркеры, гормоны, биохимия, микроскопия
Рецидив и прогрессирование опухоли
Текст/Даты/
Числа DICOM
Текст/Даты/Числа
Текст/Даты
Хронология
Хронология
Хронология
Методы визуализации
Радиологические
исследования
УЗИ, КТ, МРТ, ОФЭКТ/КТ, ПЭТ/
КТ-МРТ + контрастирование
Текст/Даты/
Числа DICOM
Хронология
Лечение
ТерапияОперации, лучевая терапия, химиотерапия,
гормонотерапия, таргетная и пр.
Текст/Даты/ЧислаХронология

Основной целью медицинского бакинга биообразцов человека является их сохранение для перспективных исследовательских (генетических, протеомных и метаболомных) и рутинных практических (трансплантация,  репродукция)  задач. В онкологии это прежде всего поиск биомаркеров возникновения и прогноза клинического “поведения” опухолей, разработка новых методов профилактики и лечения, предикция их эффективности и безопасности.
Биомаркеры определены в международной терминологии как “характеристики, которые объективно измеряются и оцениваются в качестве индикаторов нормальных и патологических биологических процессов, а также фармакологических ответов на терапевтические воздействия”. В специфике радиологических изображений биомаркерами являются электромагнитные, фотонные и звуковые сигналы, регистрируемые раз- личными методами (КТ, МРТ, ОФЭКТ, ПЭТ).

В отличие от биологических образцов, извлекаемых (физиологически, пункцией или операцией) из тела пациента, радиологические биомаркеры оцениваются неинвазивно и в большинстве случаев позволяют избегать инвазивных процедур. В реальной клинической практике методы лучевой визуализации широко используются для обнаружения опухолей, оценки их агрессивности и стадии, объективного ответа на лечение (RECIST). Объем информации (DICOM), получаемой при визуализации, очень большой и требует специальных средств анализа и хранения. Клиническая валидация радиологических биомаркеров требует соответствующей инфраструктуры и времени (табл. 2).

Таблица 2. Радиологические биомаркеры

Радиологические характеристикиИзучаемый механизмТехнология визуализации
Объем
Перфузия
Броуновское движение молекул воды в объеме ткани
Анализ структуры
Спектроскопия
Эластичность
Метаболизм
Рецепторы
Плотность
Интенсивность
и особенности сигнала
Рост и уменьшение очага(ов) опухоли
Васкуляризация и ангиогенез опухоли
Клеточность опухоли
Структура паренхимы опухоли
Внутритканевая концентрация различных метаболитов
Фибропластический компонент
Метаболическая активность опухоли (глюкоза, холин, кальций,
фосфор, допамин, адреналин)
Экспрессия рецепторов (соматотропных, эстрогена, простатспецифического антигена)
Тип ткани (солидная, жидкая, смешанная)
Структурные свойства опухоли
КТ, МРТ, УЗИ
КТ, МРТ + контрастирование
МРТ (диффузно-взвешенное)
КТ, МРТ
МРТ
Ультразвуковая эластография
ОФЭКТ/КТ, ПЭТ/КТ-МРТ
ОФЭКТ/КТ, ПЭТ/КТ-МРТ
КТ
МРТ

 Методы лучевой визуализации играют важнейшую роль в диагностике опухоли, оценке стадии и динамическом мониторинге онкологических пациентов. Их ценность многократно увеличивается при сопоставлении с результатами скрининга, лечения пациентов, данных генетики, протеомики и метаболомики. Речь идет о мультимодальных биобанках, где наряду с биологическими образцами хранятся и обновляются цифровые копии различных методов визуализации (DICOM-PAXS), в том числе морфологических исследований, а также клинические и лабораторные данные.

Анализ этих данных,полученных в результате динамического наблюдения за пациентами, включенными в биобанк, позволяет совершенствовать профилактику, диагностику, лечение и реабилитацию онкологических пациентов, а также пополнять доказательную базу медицинских знаний, изучать генетические и метаболические основы канцерогенеза, генерировать новые диагностические и лекарственные методы, совершенствовать существующие лечебно-профилактические алгоритмы.

Самым надежным и изученным методом длительного сохранения нативных биологических образцов является глубокая заморозка. С позиции термодинамики все тепловые процессы останавливаются при температуре абсолютного нуля (273,15 °С), который на практике недостижим. Минимально возможная заморозка равна температуре кипения жидкого азота (195,75 °С).
Хранение в парах азота позволяет удерживать температуру в пределах
138 °С (в зависимости от уровня над жидким азотом).
В низкотемпературных морозильниках (фризерах) достигаются температуры от
50 до 90 °С (в среднем 80 °С), в морозильных камерах – от 18 до 35 °С (в среднем 20 °С).
В этой связи хранение образцов цельной крови целесообразно производить при температуре
80 °С, а сыворотки крови (метаболомные анализы) – при температуре 20 °С, если анализ планируется выполнить в течение года. Для более длительного хранения рекомендуется содержание биообразцов при температуре 80 и 196 °С, что позволяет сохранить максимальное количество метаболитов. Максимально возможная скорость замораживания в биомедицинских фризерах на 80 °С составляет 5–7 °С/мин.

При глубоком замораживании, как и при последующем размораживании, молекулы воды проходят фазу кристаллизации, что приводит к разрушению кристаллами клеточных мембран. С целью предотвращения данного эффекта в буферный раствор добавляют раствор диметилсульфоксида (ДМСО, димексид) и другие буферы. Это позволяет повысить способность клетокк оживлению (ревитализации) при разморозке и используется, например, в эндокринологии для криоконсервации паращитовидных желез. Скорость заморозки и разморозки имеет чрезвычайно важное значение при криоконсервации потенциально ревитализируемых объектов (половые клетки, клеточные линии, трансплантаты, эмбрионы).
При замораживании и размораживании происходят аналогичные химические и физические процессы, приводящие к росту и уменьшению соответственно кристаллов воды. Это может приводить к так называемому рекристаллизирующему повреждению  клеток. В общем смысле чем быстрее происходит замораживание или размораживаниез биообразца, тем быстрее происходит кристаллизация и декристаллизация соответственно. Многие исследователи рекомендуют придерживаться одинаковой скорости замораживания и размораживания. Однако, например, добавление буферных компонентов может менять ситуацию. Так, эмбрион мыши, медленно замороженный с добавлением раствора ДМСО, выживает лишь при быстром размораживании. С другой стороны, такой же эмбрион, медленно замороженный в глицероле, способен выжить лишь при медленной разморозке.
В зависимости от требований, предъявляемых к качеству биологического материла после его размораживания, рекомендуются различные методы пробоподготовки, температурные режимы замораживания (стандартный или программируемый), хранения и размораживания. В этой связи очень важен правильный выбор расходных материалов, методик и криогенной техники (рис. 1).

Криоконсервация биологических образцов (криобанк)

Биобанк

 Рис. 1. Принципы криоконсервации биологических образцов. Примечание: * – при наличии в удаленном
препарате.

Для исследовательских целей, если речь не идет о клеточных линиях, ревитализация (оживление) клеток при разморозке не требуется. Поэтому для хранения, например, сыворотки крови могут использоваться обычные морозильные камеры (-18…-35 °С), а для цельной крови и плазмы – низкотемпературные фризеры (-70…-90 °С). Если речь идет о половых клетках (сперматозоиды,яйцеклетки) или клеточных культурах, то необходим метод высокоскоростной заморозки до состояния стекла (витрификация) с последующим хранением в жидком азоте или его парах (-138…-196 °С). Жидкий азот – инертный элемент и не вступает в хими ческую реакцию с биологическим образцом.
Вместе с тем, жидкий азот является хорошим консервантом, а также обладает высокой проникающей способностью (проникает под крышки пробирок). Может создаваться неверное мнение, что следует хранить биообразцы в жидкой фазе азота, но последние тенденции/рекомендации в данной области состоят в том, чтобы избегать хранения образцов в жидкой фазе, так как существует риск кросс-контаминации.

При снижении температуры хранения биологического образца, например, во время временного изъятия другого образца в коробке или при аварийном отключении электропитания, происходит фазовый переход, чреватый деградацией образца. В этой связи необходимо стремиться к использованию специализированных биомедицинских фризеров с возможностью программируемой заморозки/разморозки дискретных биологических образцов. Управляемость, отказоустойчивость, автоматизация, а также резервирование рабочих процессов загрузки и выгрузки биообразцов – важные критерии при подборе оптимальных технических параметров.
Биологические образцы подразделяют на жидкие (цельная кровь, плазма, сыворотка, спинномозговая жидкость, моча, бронхоальвеолярный лаваж, слюна, асцитическая жидкость, семенная жидкость) и солидные (мягкие ткани, кость). В обоих случаях образец содержит воду, ионы, клетки, карбогидраты, протеины, липиды и другие метаболиты, являющиеся биомаркерами.
Если производится преаналитическая пробоподготовка жидких образцов, то она включает в себя следующие временные периоды:
1) время до центрифугирования;
2) центрифугирование в один или два этапа.
Даже если этот период не превышает 2 ч, это влияет на сохранность белков и других компонентов. S. Ayache и соавт. обнаружили значительное изменение уровней 37 различных факторов (в основном цитокинов) в крови в пределах 2 ч после пункции вены Данное исследование подтвердило, что эти изменения возникли вследствие продукции цитокинов нейтрофилами в результате стресса от забора крови и ее кратковременного хранения в холодильнике (+4 °С) илипри комнатной температуре. R.E. Banksг и соавт. изучали стабильность низкомолекулярных белков и обнаружили с помощью SELDI-масс-спектрометрии выраженные изменения в период времени от 30 до 60 мин после забора крови, остававшиеся стабильными в течение 4 ч после забора крови. Температура хранения образцов после забора крови также влияет на стабильность белков. Значительные потери белковых фракций были обнаружены масс-спектрометрическими методами в случаях, когда сыворотка хранилась при комнатной температуре более 4 ч или в холодильнике в течение 24 ч.
Время ишемии биологического образца как стрессовый фактор, запускающий каскад молекулярных событий, негативно влияет на биомаркеры. И чем время больше, тем значительнее это влияние. Это доказано как молекулярно-биологическими, так и стандартными иммуногистохимическими (ИГХ) методами. Недавно ыполненное исследование F. Meric-Bernstam и соавт. (2014) показало, что биообразцы рака молочной железы, взятые пункционной биопсией, отличались маркерами PI3K киназного сигнального пути при сравнении с послеоперационными образцами. Предположительно, это связано с отсутствием фосфорилирования в хирур гических образцах или с холодной ишемией после хирургического удаления.
При сборе жидких образцов характеристика криоконтейнера также имеет важное значение. Важен материал, из которого сделан сам криоконтейнер и его компоненты (крышка, прокладка), а также наполнители внутри него (антикоагулянт для крови,стабилизирующие агенты для нуклеиновых кислот) , что может влиять на результаты исследований биомаркеров. Например, этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) необходим для стабилизации фолатов и витаминов.
Во многих исследованиях показано, что состав криоконтейнера влияет на результаты анализа гормонов, протеинов и других биомаркеров, произведенных различными аналитическими методами.

Наиболее подходящим составом для криопробирки является полипропилен (англ. маркировка PP). Крышка должна быть винтовая с внутренней резьбой и внутренним силиконовым кольцом-прокладкой. Крио пробирки с внутренней резьбой и силиконовым уплотнителем признаны не самым лучшим решением. В связи с постоянным увеличением коллекций биобанков одним из ключевых параметров становится соотношение рабочего объема к размеру криопробирок. Внешняя резьба обеспечивает лучшее соотношение.
Кроме этого, силиконовый уплотнитель часто выдавливается при закручивании, что впоследствии может привести к потере образца.
Современное решение – это вплавленный в крышку уплотнитель из TPE – для криопробирок как с внешней резьбой, так и с внутренней. Такая конструкция позволяет наилучшим образом обеспечить герметичность и сохранность биологического образца. Для солидных образцов целесообразно оборачивание в неадгезивный инертный материал (например, тонкую алюминиевую фольгу) для предотвращения примораживания к стенке криоконтейнера и удобства последующего извлечения Международные стандарты (ISBER) рекомендуют использовать штрихкодирование SPREC (Standard PRE-analytical Code) с указанием (согласно международным кодам) помимо уникального номера субъекта (пациента):
 

 Если говорить о минимальной ассоциированной информации, можно также добавить информацию о MIABIS (Minimum Information About BIobank Data Sharing, https://github.com/MIABIS/miabis/wiki). Это достаточно интересный, но обширный вопрос.
С развитием генетики и протеомики в онкологии становится возможным в анализе крови у здорового человека превентивно обнаружить мутантные ДНК, подозрительные на наличие опухоли. При этом известно, что
пролиферативные процессы (воспаление, регенерация, функциональная активность, предрак) повышают вероятность ложноположительных результатов. Кроме того, есть риск ложноотрицательной диагностики.
Радиологическая визуализация в сочетании с онкомаркерами, факторами риска, семейным анамнезом позволяет оперативно и неинвазивно оценить объем и природу опухолевой патологии (рис. 2). 

Пример модели биобанкинга в онкологии

Биобанк

 Рис. 2. Биобанкинг в онкологии в эпоху цифровой персонализированной медицины.

Оцифрованные микроскопические морфологические изображения высокого разрешения и результаты лучевых методов визуализации (УЗИ, КТ, МРТ, ОФЭКТ, ПЭТ и их совмещение) являются важнейшим субстратом для дистанционного (телемедицинского) консультирования.
Понимание генетической, сигнальной и метаболической природы опухолевых заболеваний расширяет горизонты персонализированной медицины. Сопоставление результатов молекулярно-генетических исследований с радиологической
in vivo визуализацией патологических очагов имеет прикладное значение, например, для персонализированного подбора лекарственных препаратов и схемы лечения, прицельного мониторинга очагов в его процессе, прогнозирования “ответчиков” и “неответчиков” на лечение.

Биобанк радиологических исследований в дополнение к репозиторию биологических образцов при соответствующем развитии и интеграции информационных ресурсов является передовым направлением развития персонализированной цифровой медицины. Научно-прикладная ценность подобной комбинации в онкологии заключается в возможности изучения “радиогеномного” фенотипа опухолей и их “поведения” в процессе лечения.

X